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技術文章 > 免疫染色的方法與步驟

免疫染色包括免疫熒光(IF)、免疫組化(IHC)、免疫細胞化學(ICC)等,可以參考如下步驟進行操作。
  • 樣品準備
    • 對于貼壁細胞:
      可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培養細胞,然后到預定時間時進行固定等后續操作。
      也可以用潔凈的蓋玻片,70%乙醇中浸泡后,用無菌的鑷子放置到6孔板內,然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養液洗去殘留的乙醇。這時就可以種入細胞進行培養,待細胞貼在蓋玻片上生長良好后,即可進行固定等后續操作。
    • 對于懸浮細胞:
      把細胞先在固定液中固定,然后把細胞滴加在載玻片上,干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續操作。如果細胞的粘附能力不佳,可以在載玻片上用PDL等物質進行處理,以增強載玻片的粘附能力。
    • 對于冷凍切片:
      切片放置在載玻片上后,可以直接進行固定等后續操作。
    • 對于石蠟切片:
      脫蠟:切片在二甲苯中脫蠟5分鐘,再換用新鮮的二甲苯脫蠟,共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘,兩次。90%乙醇5分鐘,兩次,70%乙醇5分鐘,一次。蒸餾水5分鐘,兩次。
      抗原修復:根據不同的抗原和抗體,可以選擇把切片放置在如下抗原修復液中,10mM檸檬酸鈉,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,或10mM Tris,pH10.0,95℃加熱12分鐘,大約在30分鐘內緩慢冷卻至室溫。
  • 固定
    可以使用適當的固定液固定細胞或切片,例如百奧萊博的免疫染色固定液(YT086)。固定完畢后,可以用免疫染色洗滌液(YT089)洗滌兩次,每次5分鐘。
  • 封閉
    加入免疫染色封閉液(YT087),封閉60分鐘。如果背景較高,可以4℃封閉過夜。
    從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產生較高的背景。
    在整個免疫染色過程中我們推薦使用側擺搖床,側向擺動速度比較緩慢,而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣品比較容易脫落,也可以把所有的步驟放置在桌面上靜止進行,即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動,但靜止操作時宜適當延長作用時間或次數。
  • 一抗孵育
    參考一抗的說明書,按照適當比例用免疫染色一抗稀釋液(YT088)稀釋一抗。
    用微型臺式真空泵吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以4℃緩慢搖動孵育過夜。
    回收一抗。加入免疫染色洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
  • 二抗孵育
    參考二抗的說明書,按照適當比例用免疫熒光染色二抗稀釋液(YT090)稀釋熒光標記的二抗,或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液(YT091)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標記的二抗。
    用微型臺式真空泵吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
    回收二抗。加入免疫染色洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高,可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
  • 蛋白檢測
    對于免疫熒光染色,此時已經可以直接到熒光顯微鏡下觀察。
    對于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當的顯色底物,或AB檢測體系等進行后續檢測。
  • 多重染色
    如果進行的是免疫熒光染色,通常都可以進行多重染色。對于可以產生有色沉淀物的染色反應,例如DAB染色,一般不適合再進行多重染色。
    多重熒光染色:
    可使用紅色熒光、綠色熒光和藍色熒光進行三重熒光染色。例如用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3(YT115)進行紅色熒光染色,隨后可以用免疫熒光染色試劑盒-抗兔FITC(YT109)進行綠色熒光染色,在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒(YT118)對細胞核進行染色,染色后為藍色熒光。
    用HE染色進行復染:
    免疫熒光染色后可以用蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(YT165)進行HE染色。
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