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技術文章 > DNA螢光染色法檢測支原體

原理
利用螢光染劑(bisbenzimide, Hoechst 33258)偵測支原體污染。此染劑會結合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區域,因為支原體之DNA中A-T含量占多數(55~80%),所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經染色后,在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點,即為支原體之DNA,證明有支原體之污染。

測試步驟用間接步驟,將待測細胞懸浮液或細胞培養液接種于指示細胞培養液中(indicator cell,例如Vero cell or 3T6 cell),然后培養指示細胞再作螢光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內作為對照。

待測細胞亦可作直接測試,但需為吸附型細胞,培養后直接作螢光染色。有些細胞易有螢光背景,而干擾結果判讀,則建議使用接種于指示細胞之步驟。
特點
簡單、經濟與靈敏,廣泛使用,可作為例行之偵測步驟??梢詡蓽y不易培養之支原體,例如M. hyorhinis,較直接培養法快,約一星期即可知道結果。

缺點:有時仍會有螢光背景,影響判讀。

材料
Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物:35 or 60mm sterile plate內放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內,使用前過火滅菌﹚,一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片,細胞面朝下放在玻片上觀察。

Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070),細胞須先測試無污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制試劑:

無菌HBSS:配制Hanks’ balanced salt solution,以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。

Hoechst 33258 stock solution(100X)︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS,置于棕色瓶中,室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后,以1ml分裝至1.5ml小離心管中,貯存于-20℃。

Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution,加入sterile 100 ml HBSS中,室溫下攪拌45分鐘,置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆,避免光照,貯存于4℃。

mounting solution:22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合,以1 N NaOH調整pH至5.5(pH很重要),貯存于4℃。
固定溶液(fixative):冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合,使用前才配制。
步驟:
培養Vero細胞: Vero細胞可作長期培養或制作多個冷凍保存管,測試前解凍培養。測試前一周培養Vero細胞。
在接種測試樣品前一日,以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞,制成細胞懸浮液,以1~2x10^4 cells/ml培養于chamber slide中,每個well加入1ml細胞懸浮液,于37℃, 5%CO2培養。隔日確定生長良好后,即可接種測試樣品。
接種測試樣品:樣品種類:1ml待測之培養基,1ml待測細胞培養液(可將細胞稍微刮下﹚,0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。
將測試樣品加入chamber slide內,培養5天后,進行Hoechst 33258的螢光染色觀察。
以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組﹙或是已感染支原體之細胞培養液或冷凍細胞液﹚,負反應對照組為Vero cell之新鮮培養基( αMEM +10%FBS)。
DNA螢光染色檢測:

取出培養5日之Vero細胞,吸除培養液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,靜置10 min后,吸除固定液。重復上述之步驟,風干10分鐘。

于每個well中,加入1 ml Hoechst 33258 working solution,室溫下靜置30 min。

吸掉Hoechst 33258染液后,以無菌水洗滌3次,風干后加入1滴的mounting solution,并以蓋玻片覆蓋之。

以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后,以UV激發光束(330~380 nm)之濾光鏡,觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產生。
結果判讀
若有支原體污染,在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致,與細胞殘片染成之不規則點狀物不同。其螢光可維持數星期。
圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下,只觀察到Vero細胞的細胞核,測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點和絲狀點,表示測試樣品有支原體的污染。
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