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技術文章 > 直接培養法檢測支原體

原理:
直接培養支原體于培養基中,觀察其生長及菌落生成。
特點:
是目前最直接與靈敏之步驟,亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。
缺點:
培養時間長,須3-5星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來 (例如M. hyorhinis)。需同時培養支原體株作為正反應對照組,可能會造成污染。
材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養箱、厭氧缸(厭氧缸長期培養易有污染,所以厭氧包應用無菌水,每次打開厭氧缸后,用70% ethanol擦拭內壁。)
培養基制備:
基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養時間長,可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1:2000)至培養基中以防止其它細菌污染。

10x stock solution (1 liter) :稱取50 g dextrose,10 g L-arginine HCl,溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中,保存于 -70℃。

液體培養基 (1 liter) :稱取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中,加熱攪拌溶解之。滅菌121℃,15分鐘。待溫度降低至室溫后,于無菌操作臺內加入200ml馬血清,100ml之15% yeast extract solution,及100ml解涷之10x stock solution,混合均勻后,分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中,10ml/管。保存于4℃,期限1個月。

固體培養基 (1 liter ):稱取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red,15g Bacto agar于600ml蒸餾水中,加熱溶解之。滅菌121℃,15分鐘。放在50℃水中浴中,待溫度降低至50℃時,于無菌操作臺內加入200ml馬血清,100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution,混合均勻后,倒入60x50㎜之無菌培養皿中,5ml/培養皿。保存于4℃,期限1個月。
步驟:
取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液,接種于液體培養基中,置于37℃培養二周,觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養一周及二周后,分別取0.1 ml液體培養液涂在agar plate上,將其倒放置于37℃厭氧箱培養,培養至少3星期,持續觀察是否有支原體之菌落出現。

另取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液,涂抹在agar plate上,37℃厭氧培養3星期,持續觀察是否支原體菌落出現。

另作正負反應對照組,正反應對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。

結果判讀:

支原體生長較慢,所以先在液體培養基培養1~2周增殖后,再培養于agar plate上。需至少培養3星期后,才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。

典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like),乃是由于支原體往agar下層生長所致,為圓形無色透明菌落,大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落,有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(slime)。

若要區分細胞或是氣泡造成的類似菌落,可將其自agar plate上切下,重新培養于液體培養基中,培養一星期后再種入agar plate,若是細胞則不會生長。
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