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技術文章 > 預防及處理細胞培養時支原體的污染

Mycoplasma國內主要有三種譯名,醫學文獻譯為“支原體”(分枝原體,枝原體,類菌質體),動物醫學文獻譯為“霉形體”或“支原體”,臺灣、香港則譯為微漿菌。
支原體是目前已知一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小的原核細胞型微生物。自然界分布廣泛,種類多,有80余種,分為兩個屬:一為支原體屬(Mycoplasma),有幾十個種;另一為脲原體屬(Ureaplasma),僅有一種。與人類感染有關的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。
支原體無細胞壁,多呈不規則球狀、長絲狀,可分枝,營寄生共生或腐生。一般侵害對象為動植物,可造成多種疾病。
細胞培養(特別是傳代細胞)被支原體污染是個世界性問題。國內外研究表明,95%以上是以下四種支原體:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和菜氏無膽甾原體(A.laidlawii),為牛源性。國外調查證明,大約有二十多種支原體能污染細胞,有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。
支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染(某些支原體在人體是正常菌群)、培養基的污染、被污染細胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細胞的原始組織或器官的污染,等等。
體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力,因此培養基應達到無化學物質污染、無微生物污染(如細菌、真菌、支原體、病毒等)、無其他對細胞產生損傷作用的生物活性物質污染(如抗體、補體)。對于天然培養基,污染主要來源于取材過程及生物材料本身,應當嚴格選材,嚴格操作。對于合成培養基,污染主要來源于配制過程,配制所用的水,器皿應十分潔凈,配制后應嚴格過濾除菌。
由于體外培養細胞自身沒有抵抗污染的能力,而且培養基中的抗生素抗污染能力有限,因而培養細胞一旦發生污染多數將無法挽回。支原體污染后,因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存,培養基一般不發生渾濁,細胞無明顯變化,外觀上給人以正常感覺,實則細胞手到多方面潛在影響,如引起細胞變形,影響DNA合成,抑制細胞生長等。
組織細胞培養工作中,可以從以下幾方面來預防支原體的污染:控制環境污染;嚴格實驗操作;細胞培養基和器材要保證無菌;在細胞培養基沖加入適量的抗生素。
抗生素主要用于消毒培養液,是培養過程中預防微生物污染的重要手段,也是微生物污染不嚴重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同,應根據需要選擇。
在細胞培養過程中如果發現破碎的細胞甚多,培養細胞需要頻繁改善營養環境才能支持長期傳代培養時,應該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化,培養液也不渾濁。
支原體污染細胞后,特別是重要的細胞株,有必要清除支原體,常用方法有:抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。要注意的是:支原體沒有細胞壁,故作用于細胞壁生物合成的抗生素,如內酰胺類、萬古霉素等是不敏感的;對多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐火藥。對支原體最有抑制活性抗生素是四環素類、大環內酯類等,氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小的抑制作用。必要時更換所有培養用物。通常,濾過除菌的方法對支原體是沒有作用的。
由于一些微生物,如支原體,病毒等能通過濾膜,所以過濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險,近年來,60Co輻射滅菌技術在醫藥、食品等領域廣泛應用,由于輻射滅菌能夠徹底殺滅所有微生物。有試驗證實以2Mrad輻射處理的各培養基樣品達到了無菌要求,經多批培養試驗,輻射滅菌安全可靠;輻射滅菌的培養基營養性能不低于過濾組,證明輻射滅菌對培養基性能無不良影響;對血清的輻射滅菌試驗效果也表明60COγ射線不影響培養效果。把干粉培養基經無菌操做定量分裝于滅菌容器內,輻射后以干粉原型貯藏,不但培養基的純凈性得到保障,而且營養性能較過濾后以水溶液形式保存更穩定,對谷氨酰胺等這類水溶液不穩定者特別合適。
目前,有專門做支原體檢測的試劑盒,可以用細胞滴片檢測。市場上已有了新一代支原體抗生素M-Plasmocin(InvivoGen公司),能有效的殺滅支原體,又不影響細胞本身的代謝,而且處理過的細胞不會重新感染支原體。另外,配合支原體檢測試劑盒(市場上有售,如美國ICN公司的產品),可以幫助盡快發現支原體的污染。
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