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技術文章 > 支原體培養的技巧

支原體(霉形體)的培養技巧支原體是介于病毒與細菌之間的一類微生物,在自然界廣泛存在,使人和多種動物、植物害病。

它缺乏細胞壁而不同于細菌,能在無細胞培養基生長繁殖,并含有RNA和DNA而有別于病毒。支原體以二分裂方式繁殖,基本形態為圓形、絲狀形,后者易形成分枝狀菌絲,因而得名支原體。其大小介于病毒和細菌之間,最小直徑125-250nm,可通過濾器?;蚪M小只5×108道爾頓,是已知能自行復制繁殖的原核生物中最小的,因而生物合成能力低,體外培養時需要富含營養,如血清、酵母浸液、核酸等復雜成分的培養基才能生長。它生長緩慢,倍增時間1-6小時,最長需三周才形成菌落。菌落中心長入瓊脂內部形成中央較密的核,從上方觀察可見“煎蛋樣”的特殊菌落,因為菌落很小需在低倍鏡下才能看見。Mp從發酵葡萄糖取得生長所需能量。Uu則是通過水解尿素獲得能量。支原體對抑制細胞壁合成的青霉類抗生素不敏感,對抑制蛋白質合成的抗生素如四環素和大環內酯類抗生素的紅霉素等敏感。

一般培養比較多的是肺炎支原體(MP),解脲脲原體(UU)是耐酸不耐堿的,UU培養的原理是在于其菌體中含有脲酶,而UU培養基中含有尿素,UU的生長需要其本身的脲酶分解尿素益提供其自身生長所需要的營養物質,UU培養基中含有指示劑酚紅,由于尿素被分解釋放出氨從而使培養基變堿而使培養基由黃變紅,但是這種紅是一種清亮的紅色,透明澄清無渾濁,UU其適宜的PH值為6.2-6.5,由于尿素分解產氨是PH上升,UU在PH值大于7的條件下會迅速死亡,因此,在培養時要隨時觀察其液體培養基的PH值,一旦看到培養基變紅,要立即取出,以防培養基PH上升導致UU死亡,一般UU需要在培養至對數生長期時是活力最強的時候(培養基呈橙紅色變化)。一般UU生長需要24小時。

UU的計數也和普通細菌不同,采用顏色單位改變法(CCU法),因為UU的生長是澄清清亮透明的,因此無法用一般的比濁法來計數!

UU的保存:在UU生長到對數生長期時,采用甘油保存法,甘油和菌液的比例為3:7,(甘油高壓滅菌),采用程序降溫法,獻4度1小時,在-20度2小時,最后放到-80度,但是在-80度最長不要超過半年,因此需要每隔2-3個月將菌株復蘇一次到對數生長期后再保存!

另外,UU生長所需要的培養基的成分一般每隔單位有所不同,但是有一點肯定,就是需要小牛血清。

器具泡酸的目的是為了去除雜質,一般在做細胞培養是需要泡酸,做細菌方面的工作要求不需要如此嚴格的,只需要洗干凈,高壓消毒就可以了,在配培養基時用的是三蒸水,把培養基配好后,最后再加入血清,然后調到所需的PH值,不可以高壓,只能用0.22um的濾膜過濾除菌!培養基配好后,4度放半年沒問題!

沒有從動物身上分離UU,但是剛一開始做時,是從病人的臨床分泌物中分離,臨床分離株需要純化,因為臨床株常常含有很多雜質,這些雜質會影響UU的生長,導致UU的CCU常常達不到10的3次方,因此對臨床株需要純化,可以在固體平板上見到油煎蛋樣菌落,用滅菌小刀切取菌落瓊脂塊,移入液體培養基中壓碎進行培養,等到培養基變黃后,用液體培養基稀釋培養物到10的-4或-5次方,再取0.2-0.4ml于固體平板上,這樣反復2-3次,就可以得到支原體的純種。

CCU一方面和細菌本身濃度有關,另一方面,確實與培養基成分有很大關系,如果培養基營養成分差,很難作出來,如果培養基中只含有鹽成分的話,高壓是沒問題的,如LB培養基,但是如果里面含有小牛血清或糖類等物質的話,絕對不可以高壓,因為這樣會破壞營養成分,只可以過濾除菌!
解脲脲原體培養基配制:(在自制培養基基礎上加:)PH:6。13
  小牛血清:30ml/250ml
  10%尿素:12 ml/250ml
  0.2%酚紅:4。5 ml/250ml
  青霉素G:50萬U/250ml
  酵母:6。25 g/250ml
  磷酸二氫鉀:0。375 g/250ml
  天門冬素:0。025 g/250ml
自制培養基包括:新鮮牛肉浸液:90毫升
  蛋白胨:1克
  氯化鈉:0。5克
  磷酸二氫鉀:0。15克
 ?。ù俗灾婆囵B基可以高壓滅菌)。
加瓊脂配成固體,一般1%即可!



支原體是能夠在無生命培養基上生長的最小微生物,其生長特點是在液基中是清亮的,因此他的計數無法通過比濁法,其對數生長期在液體中的表現是表現為橙紅色,這是支原體的代謝活力旺盛,如果顏色呈現桃紅色或深紅色,這時UU的活力就會下降,因為UU的最合適PH為6.0-6.5,這時培養基的PH偏堿,UU可能已死亡。為了區分顏色,可以用一管液體培養基作為顏色改變對照,黃色和橙紅色還是比較好區分的!

Uu的最適生長PH在6.0-6.1之間,這可能與培養基的配制有關。關于Uu的計數,CCu是最好的方法:200ul菌液加入第一瓶1.8ml液態培養基中混勻,然后從中取出200ul加入第二瓶1.8ml液體培養基中,混勻,以此類推,10倍稀釋11瓶,做3組平行試驗,求平均值即可。注意,每步操作都要換槍頭。

對于Uu的保存,其實方法也很簡單:
  1、用液體培養基培養15-17h(溶液有桔黃色變為橙紅色,而且基本在對數生長期左右),直接放入0度或-20度,2個月是沒問題的,如果不放心的話,可隔一個月檢查一下活性。
  2、如果條件允許的話,可將培養至對數生長期的陽性液先預凍,然后抽真空即可。保存幾年是沒問題的。復蘇的時候,直接向其中加入Uu培養基培養即可。
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