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技術文章 > 支原體污染的特點及檢驗方法

支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨立生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性??蔀閳A形、絲狀或梨形。
支原體形態多變,在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似,但微絨毛電子密度比支原體小,且中央無顆粒群或中央束。
支原體代謝需固醇類物質、部分種類需要精氨酸、O2或葡萄糖,每一種支原體都有自身持點。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6—8.0),對酸耐受性差。對熱比較敏感,對一般抗生素不敏感。
支原體污染細胞后。培養液可不發生混濁。多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著,細微變化也可由于傳代、換液而緩解。因此易被忽視。但個別嚴重者,可致細胞增殖緩慢。甚至從培養器皿脫落。
為確定有無支原體污染可做如下檢測:
①相差顯微境檢測:將細胞按種于事先放置于培養瓶內的蓋玻片上,24h后取出,用相差油鏡觀察。支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。
②熒光染色法:熒光染色用能與DNA特異性結合的熒光染料Hoechst 33258,可使支原體內含有的DNA著色,染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下:首先將細胞接種蓋玻片上,在細胞未長滿前取出玻片,用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下,用1:3醋酸甲酵固定10Min,然后用生理鹽水漂洗。置于用生理鹽水配濃度為50pg/ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向細胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數滴,然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。
③電鏡檢查;用掃描電鏡方法簡便快速。也可以利用透射電鏡。
④DNA分子條文檢查或支原體培養等方法:檢出率高。但方法較為復雜
支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物,大小一般在0.3-0.5um之間,呈高度多形性,有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態。它不同于細胞,也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色,用姬姆薩染色很淺,革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養中生長,營養要求比細菌高。
細胞培養(特別是傳代細胞)被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養中支原體感染發生率達到63%,支原體感染發生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達,又不能通過可視法對其進行檢測,而且它對細胞的生長率影響較小,不易引起注意。國內外研究表明,95%以上是以下四種支原體:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和萊氏無膽支原體(A.laidlawii),為牛源性。以上是最常見的污染細胞培養的支原體菌群,但能夠污染細胞的支原體種類是很多的,國外調查證明,大約有二十多種支原體能污染細胞,有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。
支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。
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