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技術文章 > 支原體培養方法

支原體又稱霉形體,是很小的原核細胞,完全沒有細胞壁.菌體形態多變,具高度多形性,球形、梨形、分枝的或螺旋的絲狀等。營養要求苛刻,在高血清量的復雜培養基上生長,在固體培養基上菌落呈油煎荷包蛋樣特征性外觀。
培養基:牛心湯復合培養基等。分離培養:無菌采取肺、肝、脾、腎組織,直接剪成小塊放在固體培養基上劃一直線,再用無菌鉑耳環在與其垂直方向劃線,或者將組織塊剪碎磨成勻槳,經液體培養基連續系列稀釋后培養.若當液體材料為牛乳、排泄物、胎液等,可直接取0.2ML接種于液體培養基或取0.1ML接種于固體培養基。固體瓊脂平板置37攝氏度潮濕需氧條件或在5%二氧化碳下培養48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立體顯微鏡檢查,若有特異菌落出現,應選取散在的單個菌落用無菌解剖刀切下小瓊脂塊,用巴氏吸管小心地將菌落和周圍瓊脂吸入,再將其移入盛有2-3ML的液體肉湯培養管培養48h,將其培養物通過0.45微升孔徑大小的濾膜過濾后作1:10和1:100稀釋,每一個稀釋液取0.05ML涂布于幾個瓊脂平板,即可得到純的支原體培養物。

牛心湯復合培養基:
  牛心湯1000ml
  蛋白胨10g
  氯化鈉5ml
  酵母提取液10ml
  無菌馬血清200ml
  1.25%醋酸鉈溶液20ml
  青霉素200IU/ml

實驗 支MP 肺炎支原體培養實驗

一、標本采集

支原體常侵及人和動物的粘膜表面,一般可用棉花拭子涂抹取樣后放入2~3ml支原體液體培養基的小管中,或取其分泌液,若標本是組織塊,可在滅菌乳缽或玻璃勻漿后接種,取樣后應盡快接種培養。

二、分離培養

1、支原體固體培養基接種法 轉動拭子將標本液體盡量擠出,用無菌滴管吸1~2滴接種在平皿上蓋好,用L棒涂抹或傾斜轉動平皿使標本均勻分布,置37℃孵育。

2、支原體半固體培養基接種法 混種法:在制備半固體培養基時,培養基加熱溶化,溫度降至50℃時,添加動物血清、酵母浸液及青霉素后混勻,待冷卻至37~40℃時,用無菌滴管吸取標本0.5~1ml加入培養基中,充分混勻,凝固后置37℃孵育。

3、穿刺接種法:方法同細菌接種法。

三、結果觀察
  絕大多數支原體為兼性厭氧,少數在含10% CO2和相對濕度80~90%的大氣環境中生長良好。支原體生長緩慢,多數于3~4d長出菌落,少數于1~2w方長出典型菌落,在平皿固體培養基上生長的菌落呈"油煎蛋"狀,邊緣不整齊。

四、附錄
  糖酵解培養基(肺炎支原體培養基)
  基礎培養基 70ml
  馬(或牛血清) 20ml
  25%酵母浸液 10ml
  0.4%酚紅 0.5ml
  1%醋酸鉈 2.5ml
  青霉素10000IU/ml 5.0ml
  調pH 7.8
  肺炎支原體培養很簡單的,特別是液體培養,不需要防護!
  配方上面的有點復雜而模糊,簡單:
  PPLO 21g(商品化買)
  酵母粉 6g
  馬血清 200ml(沒有的話用小牛血清代替)
  L-半胱氨酸 0.3g
  葡萄糖 10g
  1%酚紅 4ml
  AMP 若干(0.1-0.2g,多加點不影響)
  有時還加SMZ和TMP!
  ph要調的,大概在7.5-7.6之間吧!
  酚紅可以高壓的!
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